нейродегенерация что это такое

Содержание
  1. Нейродегенеративные заболевания
  2. Дегенеративные заболевания ЦНС
  3. Дегенеративные заболевания ЦНС: общие понятия
  4. Органические заболевания ЦНС
  5. Инфекционные заболевания ЦНС
  6. Сосудистые заболевания ЦНС
  7. Лечение и диагностика дегенеративных заболеваний ЦНС
  8. Диагностика патологий клеточного метаболизма при нейродегенеративных заболеваниях
  9. Диагностика патологий клеточного метаболизма при нейродегенеративных заболеваниях
  10. Биоэнергетика
  11. Клетка с севшими батарейками
  12. Правила движения митохондрий
  13. Нарушение динамики митохондрий при нейродегенеративных заболеваниях
  14. Заглянуть внутрь батарейки
  15. Изучение изолированных митохондрий
  16. Изучение митохондрий в целых клетках
  17. Изучение синаптосом
  18. Тест-драйв митохондрий
  19. Оценка митохондриального дыхания методом XF
  20. Митохондриальные ингибиторы, применяемые в стресс-тестах
  21. Оценка гликолиза методом XF
  22. Инструмент для мастера
  23. Заключение
  24. ЗАО «БиоХимМак» — спонсор спецпроекта по биоэнергетике
  25. Анализаторы Seahorse (Agilent Technologies, США)

Нейродегенеративные заболевания

minutko b

Лептин и инсулин являются ключевыми анорексигенными гормонами, продуцируемыми адипоцитами при накоплении жировых запасов и эндокринной поджелудочной железы соответственно. Грелин вырабатывается желудочно-кишечным трактом и стимулирует процесс потребления пищи. Множество и других периферических гормонов участвует в регуляции метаболизма, и большинство из них сигнализирует о своей активности гипоталамусу. Более того, гипоталамические нейроны также фиксируют изменения в питательных веществах, таких как глюкоза или жирные кислоты, и способны модифицировать метаболический гомеостаз.

Причины потери веса и аномального питания в течение клинической фазы AD остаются неизвестными ( метаболические изменения могут быть связаны с вышеупомянутыми поражениями гипоталамуса). Некоторые исследования подтверждают участие передачи сигналов лептина в изменениях энергетического гомеостаза при AD. Было обнаружено, что пептиды Aβ способны изменять реакцию нейронов NPU дугообразного ядра на лептин. В нескольких исследованиях также показано, что пациенты с болезнью Альцгеймера могут иметь резистентность к инсулину, и, следовательно, маловероятно, что изменения массы тела у пациентов с АD обусловлены увеличением анорексигенного действия инсулина. Кроме того, поражения дугообразного ядра благоприятствуют развитию AD-подобных поражений в экспериментальных моделях.

Помимо потери веса тела, убедительные доказательства на протяжении многих лет поддерживают взаимосвязи между изменениями гомеостаза глюкозы и патогенезом AD. Как указывалось выше, ожирение, резистентность к инсулину и диабет являются значимыми факторами риска развития болезни Альцгеймера. Экспериментальные исследования подтверждают связь между такими метаболическими нарушениями и AD с нарушенной амилоидной или тау-патологией, усиливающейся после развития ожирения и резистентности к инсулину в трансгенных моделях AD амилоидогенеза или тау-патологии. В некоторых исследованиях утверждается, что периферические нарушения склонны поддерживать устойчивость мозга к инсулину и сами по себе достаточны для развития развития тау-патологии и амилоидогенеза. Патологические изменения также могут быть связаны с гипотермией. Интересно отметить, что риск развития диабета был увеличен у пациентов с AD. Было показано, что мозг пациентов с болезнью Альцгеймера проявляет резистентность к инсулину, примером чего является увеличение кортикального фосфорилирования сайтов ингибирования серина IRS-1, которое коррелирует с когнитивными нарушениями. Это наблюдение согласуется с известной способностью передачи сигналов инсулина для содействия процессов пластичности и памяти, которые могут иметь отношение к изменениям в коре головного мозга или улучшение памяти, наблюдаемое у людей после введения интраназального инсулина. Потенциальное появление устойчивости к инсулину мозга при развитии нарушений гомеостаза глюкозы у пациентов с болезнью Альцгйемера также подтверждается известной ролью передачи сигналов инсулина в процессах регуляции энергетического метаболизма. Происхождение резистентности к инсулину мозга у пациентов с АD, по-видимому, связано с патологией Aβ и tau. С одной стороны, интра церебровентрикулярная инфузия олигомеров Aβ у мышей является достаточной для того, чтобы вызвать непереносимость периферической глюкозы с помощью механизма, функционирующего на основе гипоталамуса. С другой стороны, потеря функции tau, которая, как ожидается, будет сопровождаться последующим гиперфосфорилированием и агрегацией тау, снижает чувствительность к инсулину и связана с измененным гомеостазом глюкозы. Это соответствует увеличению ингибирования IRS-1 в мозге пациентов с чистыми тауопатиями. Было показано, что олигомеры Aβ способствуют интернализации инсулиновых рецепторов, а также активации путей JNK, PKR и TNFα, которые в свою очередь ингибируя функцию IRS-1. Кроме того, было предложено стимулировать функцию IRS-1, а также продукцию PIP3, способствуя передаче сигналов инсулина. Примечательно, что недавние данные показали, что ApoE4 способствует нейронной резистентности к инсулину и может синергически действовать вместе с поражениями.

Метаболические изменения, такие как потеря веса или резистентность к инсулину, были зафиксированы в большинстве случаев нейродегенеративных заболеваний. Во многих случаях эти изменения были причинно связаны с по крайней мере частью неврологического фенотипа и показали, что они способствуют прогрессированию болезни.

Источник

Дегенеративные заболевания ЦНС

Дегенерация центральной нервной системы представляет собой необратимые органические и функциональные изменения в спинном и головном мозге, которые приводят к психической дегенерации. Выделяют множество видов заболеваний, последствием которых являются нарушения работы нервной системы. Соответственно, лечение будет зависеть от вида заболевания и причин, его вызывающих. К сожалению, далеко не все болезни ЦНС поддаются лечению. Успешную терапию дегенеративных заболеваний ЦНС выполняют в Юсуповской больнице.

3bbcaae4627e3afd1d80f1271b73c0cf

Дегенеративные заболевания ЦНС: общие понятия

Основными характеристиками группы дегенеративных заболеваний ЦНС являются следующие критерии:

Различные заболевания ЦНС, список которых достаточно длинный, остаются на стадии изучения. Достоверно неизвестны причины возникновения атрофических процессов при нормальном функционировании нервной системы большую часть жизни человека. Тем не менее, существует ряд факторов, которые могут провоцировать дегенерацию головного мозга:

Органические заболевания ЦНС

Наличие органического заболевания центральной нервной системы означает, что головной мозг неполноценен. Патология может быть врожденной или приобретенной. Неврологи утверждают, что органические нарушения ЦНС первой стадии можно найти у 98% населения, однако они не требуют лечения. Вторая и третья стадии характеризуется более серьезными поражениями и сопровождаются значительными отклонениями.

Врожденные органические поражения головного мозга происходят в период эмбрионального развития или во время родов в результате родовой травмы. Причинами их появления могут быть неблагоприятные факторы, которые влияли на беременную женщину:

Приобретенные органические поражения могут возникнуть после инсульта, черепно-мозговой травмы, злоупотребления алкоголем и наркотиками, инфекционных заболеваний с поражением головного мозга.

Среди болезней, которые вызваны органическими поражениями ЦНС, выделяют олигофрению и деменцию. При олигофрении происходит задержка умственного развития. Заболевание возникает в период внутриутробного развития или на первом году жизни. У детей снижен интеллект, плохо развивается речь и моторика. При деменции происходит утрата уже приобретенных навыков и знаний. Постепенно деменция приводит к полной деградации человека. Рассматривая данное заболевание ЦНС, симптомы выделяют следующие: нарушение памяти, речи, ориентации в пространстве, человек не может учиться новому и теряет старые навыки и знания.

Инфекционные заболевания ЦНС

Инфекционные заболевания ЦНС являются одними из наиболее распространенных неврологических патологий. Заболевания ЦНС, вызванные инфекцией, очень опасны. Они имеют тяжелое течение, оставляют серьезные последствия и значительный неврологический дефицит. Инфекционные заболевания ЦНС могут вызывать бактерии, вирусы, грибковые заболевания. Чаще всего заболевания развиваются при проникновении в организм менингококка, стафилококка, пневмококка, энтеровирусов ECHO и Коксаки, эпидемического паротита, кандиды. Входными воротами для инфекции являются ЛОР-органы, также она передаётся контактным, гематогенным, лимфогенным, периневральным путем.

Инфекция может поражать нервную систему как первичное заболевание или возникнуть вторично, в результате развития инфекционного процесса вне ЦНС. К инфекционным заболеваниям ЦНС относят:

Сосудистые заболевания ЦНС

Нарушение кровообращения в головном мозге провоцирует развитие сосудистых заболеваний ЦНС. Эти патологии чрезвычайно опасны, поскольку приводят в большинстве случаев к инвалидизации человека. Также сосудистые заболевания ЦНС имеют большой процент смертности. Поражение головного мозга происходит в результате ишемических и геморрагических инсультов, транзиторных ишемических атак, спонтанных субарахноидальных кровоизлияний. Причинами подобных патологий являются:

Пусковым механизмом развития инсультов могут быть сильные стрессы, судорожные припадки, алкогольная интоксикация, резкие перепады температуры тела. Сосудистое заболевание ЦНС чаще всего возникает спонтанно и требует незамедлительного обращения за медицинской помощью.

Лечение и диагностика дегенеративных заболеваний ЦНС

Опасность дегенеративных заболеваний ЦНС состоит в том, что их сложно предвидеть. При наличии провоцирующих факторов в жизни человека рекомендуется вести здоровый образ жизни и регулярно посещать невролога для профилактических осмотров. Заподозрив признаки заболевания ЦНС, следует немедленно обратиться к врачу. Чем раньше будет выявлено заболевание, тем больше шансов замедлить прогрессирование дегенеративных процессов в головном мозге.

Диагностика и лечение дегенеративных заболеваний будет зависеть от вида патологии. Определив клиническую картину болезни, врач назначит исследования для уточнения состояния пациента. Они могут включать лабораторные анализы, УЗИ, МРТ, КТ, и психологические тесты для определения состояния когнитивных навыков.

В Юсуповской больнице города Москвы работает клиника неврологии, в которой оказывают помощь высококвалифицированные неврологи, доктора наук. Врачи Юсуповской больницы имеют большой опыт лечения дегенеративных заболеваний ЦНС и используют в своей работе новейшие методики терапии и реабилитации, что позволяет браться за самые сложные случаи.

Обратиться за помощью, записаться на прием и получить консультацию специалистов можно по телефону.

Источник

Диагностика патологий клеточного метаболизма при нейродегенеративных заболеваниях

Диагностика патологий клеточного метаболизма при нейродегенеративных заболеваниях

Нейродегенеративные заболевания характеризуются постепенной потерей нейронов в различных структурах центральной нервной системы. Одной из причин гибели нейронов могут быть нарушения работы митохондрий.

Автор
Редактор

Нейродегенеративные заболевания — это большая группа неврологических расстройств, связанная с постепенным уменьшением количества нервных клеток из-за специфических изменений их метаболизма. К числу этих недугов относят болезни Альцгеймера, Паркинсона и ряд других, более редких патологий (например, хорею Гентингтона). Современные методы лечения имеют ограниченную эффективность и в лучшем случае помогают замедлить их прогрессирование. Если существующие подходы к решению проблемы не работают, значит нужно подойти к ней с другой стороны. И новые данные могут оказаться полезными для разработки более эффективных методов лечения.

aa5a19c68fb4548b71c6b73999506088

Биоэнергетика

Спецпроект о клеточном энергетическом метаболизме, работе митохондрий и АТФ, а также о заболеваниях, связанных с нарушениями функций клеточных «батареек».

Спонсор спецпроекта — «БиоХимМак» — поставщик научного и медицинского оборудования в лаборатории России и стран СНГ.

Статья, которую вы сейчас читаете, является частью спецпроекта «Биоэнергетика», которую «Биомолекула» делает совместно с компанией «БиоХимМак». В цикле уже вышел обзор о болезнях и изменениях клеточного метаболизма [1] и статья, посвящённая нарушению работы митохондрий при онкологических заболеваниях [2]. В них обсуждается роль митохондрий в здоровых клетках и клетках, которые подвержены патологическим изменениям. Эта, последняя статья цикла, рассказывает о митохондриальной дисфункции при нейродегенеративных заболеваниях — болезнях Альцгеймера, Паркинсона и других неврологических расстройствах. Сначала мы обсудим, как при этих болезнях меняется функционирование митохондрий. Затем рассмотрим существующие методы исследования их работы в нервных клетках и использование получаемой при этом информации.

Клетка с севшими батарейками

Каждое из нейродегенеративных заболеваний связано с изменениями разных метаболических путей внутри нервной клетки. Исследования выявили биохимические маркеры, соответствующие каждой из болезней (табл. 1) [3].

Таблица 1. Биохимические маркеры нейродегенеративных заболеваний.Информаия из [3]

Болезнь Биохимические маркеры болезни
Болезнь Альцгеймера Aβ1—42 пептид в плазме и цереброспинальной жидкости (ЦСЖ)
Тау-белок в ЦСЖ
Фосфорилированный тау-белок
Болезнь Паркинсона Снижение уровня дофаминового транспортёра (DAT)
Тельца Леви
Боковой амиотрофический склероз Цитокины
Глутатион
8-гидрокси-2’-деоксигуанозин
Супероксиддисмутаза-1
Метаботропный рецептор к глутамату 2-го типа
Болезнь Гентингтона Гормоны роста
Цитокины
Глутатион
8-гидрокси-2’-деоксигуанозин
Супероксиддисмутаза-1
Метаботропный рецептор к глутамату 2-го типа

Углубленный анализ метаболических изменений в нервных клетках определил, что в патологии каждого нейродегенеративного заболевания в той или иной степени задействованы митохондрии. Митохондрии — это органеллы, которые, несмотря на свой небольшой размер, являются активными участниками ключевых биохимических процессов, протекающих в клетках [1]. Основная функция митохондрий заключается в поддержании энергетического баланса клеток. Эти органеллы поддерживают окислительно-восстановительный баланс клетки и регулируют гомеостаз кальция. С работой митохондрий напрямую связаны процессы запрограммированной и не запрограммированной клеточной смерти.

Обсуждая вопрос энергетического обеспечения, надо вспомнить, что мозг потребляет до 20% всей энергии, вырабатываемой в организме. И если энергетическая функция митохондрий будет нарушена, это быстро скажется на работе центральной нервной системы. Важности митохондриям добавляет то, что нейроны в сравнении с другими типами клеток обладают меньшей способностью самостоятельно получать энергию за счет гликолиза. Получается, изменения в работе митохондрий приведут к тому, что нейрон перестает полноценно выполнять свои функции.

Правила движения митохондрий

Митохондриальная дисфункция при нейродегенеративных заболеваниях хорошо изучена [4]. Одной из ее причин может быть изменение нормальной динамики этих органелл. В нервной клетке с митохондриями постоянно что-то происходит [5]. Они:

Чтобы наглядно представить себе эти процессы, сравним митохондрию с комочком теста на столе при приготовлении пирожков. Если комочек большой, то из него можно сделать два комочка поменьше. Если теста мало, то можно взять другой комочек и слепить их вместе. Когда теста в комке достаточно, он отправляется туда, куда нужно — в угол доски, где его ждет дальнейшее включение в пекарский «метаболизм».

Изменение числа и положения митохондрий в клетке помогает нейрону адаптироваться к изменению функций. Транспорт митохондрий в аксон является реакцией на повышение потребности в энергии. Число митохондрий также меняется в ответ на изменение условий. Если нужно меньше энергии, число митохондрий снижается, а вслед за этим снижается и энергопродукция клетки.

Нарушение динамики митохондрий изменяет их функциональное состояние и приводит к нарушениям в работе нервной клетки (рис. 1).

01.dinamika mitohondrij

Рисунок 1. Динамика митохондрий в клетках животных. Митохондрии в нейронах могут разделяться (а) и сливаться (б). Кроме этого, в соответствии с энергетическими потребностями клетки митохондрии могут перемещаться в область аксона и покидать ее (в—д).

Нарушение динамики митохондрий при нейродегенеративных заболеваниях

Мутации в генах, которые кодируют факторы разделения, и дефицит самих факторов приведут к избыточному слиянию митохондрий. При дефектах в белках, ответственных за слияние митохондрий, мы будем наблюдать их избыточную фрагментацию. Нарушение слияния митохондрий в конечном счете может привести к мутациям в митохондриальной ДНК и появлению органелл с измененной функцией. Прежде всего, это касается процессов окислительного фосфорилирования.

Нарушения в динамике митохондрий при отдельных нейродегенеративных заболеваниях:

Все изменения в функции митохондрий нельзя объяснить исключительно нарушениями их динамики. Первичные метаболические нарушения при нейродегенеративных заболеваниях (см. табл. 1) могут вмешаться в работу митохондрий и сами по себе.

Ключевой «цех» митохондрий, который активно производит АТФ — это дыхательная цепь переноса электронов (рис. 2). Она состоит из четырех комплексов, расположенных на внутренней мембране митохондрии [17].

02.dyhatelnaja cep mitohondrij

Рисунок 2. Строение дыхательной цепи в митохондриях. C I — комплекс I (NADH-дегидрогеназный комплекс); C II — комплекс II (сукцинатдегидрогеназа); C III — комплекс III (цитохром-bc1-комплекс); C IV — комплекс IV (цитохром-с-оксидаза); Cyt C — цитохром C.

При нейродегенеративных заболеваниях нарушения распространяются не на всю дыхательную цепь, а на отдельные ее элементы, снижая эффективность их работы [18]:

Итогом сбоя в одном элементе становится нарушение работы всей цепи.

Заглянуть внутрь батарейки

В настоящее время существует множество способов, которые позволяют оценить работу митохондрий [19]. Все их можно условно поделить на три группы: изучение изолированных митохондрий, изучение митохондрий в целых клетках и изучение синаптосом.

Изучение изолированных митохондрий

Этот метод позволяет прицельно изучить саму органеллу, но при этом мы не можем полностью оценить воздействие цитозольных факторов на функцию митохондрий. Как правило, выделение митохондрий проводят центрифугированием при низких температурах (0–2 градуса по Цельсию) [20]. Функцию митохондрий оценивают по их способности поглощать кислород, по соотношению окисленных и восстановленных метаболитов. Также отдельно можно изучить активность ферментов дыхательной цепи и синтез АТФ в митохондриях. Эти данные дают подробное представление о том, какие метаболические процессы нарушены внутри органелл, и указывают на возможные пути коррекции нарушений функции митохондрий.

Изучение митохондрий в целых клетках

Здесь трудность кроется в том, что часть веществ, необходимых для оценки работы митохондрий, не проникает через мембрану клетки. Частично это ограничение может быть снято при помощи увеличения проницаемости клеточной мембраны, но это повышает риск повреждения клетки. Для оценки митохондриальной функции у живых клеток измеряют концентрацию и парциальное давление кислорода в ткани или культуре клеток, скорость его потребления.

Изучение синаптосом

В каком-то смысле синаптосома занимает промежуточное положение между целой клеткой и отдельной митохондрией. Выделение синаптосом происходит из гомогенизированной ткани мозга, и она представляет собой изолированный участок аксона нервной клетки с пресинаптическим участком. Синаптосома содержит в себе везикулы с нейромедиатором и митохондрии. Также целой остается пресинаптическая мембрана с комплексом ионных каналов и рецепторов. Активная часть постсинаптической мембраны тоже может попасть при выделении в состав синаптосомы (рис. 3).

03.varianty sinaptosom

Рисунок 3. Варианты синаптосом, которые могут быть получены в ходе их выделения.

Синаптосома — это удобный объект для изучения синаптических нарушений при нейродегенеративных заболеваниях. Изучение синаптосом не заменяет другие методы, но дополняет их и уточняет полученные ими данные. Синаптосома — уникальный объект для изучения клеточной функции нейронов и позволяет отдельно оценить роль митохондрий в поддержании работы синапса: при исследовании синаптосом можно оценить концентрацию метаболитов, связанных с активностью митохондрий.

Исследование синаптосом при заболеваниях нервной системы началось в конце 70-х годов XX века [21]. В 1980-х гг. при изучении синаптосом у пациентов с болезнью Альцгеймера был обнаружен дефицит ацетилхолиновой [22], глутаматергической [23] и ГАМК-ергической [24] трансмиссий (передач сигнала). Исследование болезни Альцгеймера оказалось подходящим для разработки основных подходов в изучении синаптосом. Во-первых, количество пациентов, страдающих этим расстройством, велико, что позволяет собрать большое количество материала для исследования. Во-вторых, прогрессирование расстройства в бóльшей степени связывают с нарастающим снижением количества синапсов в мозге [25].

Однако анализ синаптосом может помочь не только в изучении болезни Альцгеймера. При помощи этого метода обнаружили, что мутантный белок HTT при болезни Гентингтона подавляет транспорт митохондрий [26]. Изучение синаптосом приложимо и в случае деменции с тельцами Леви [27].

Все три традиционных метода диагностики метаболической функции митохондрий дают много полезной информации, но при этом обладают рядом недостатков:

Эти сложности подтолкнули индустрию к поискам новых решений.

Тест-драйв митохондрий

Одним из самых перспективных методов для исследования митохондриальной функции является их изучение анализатором внеклеточных потоков (extracellular flux, XF). Такой прибор позволяет оценить показатели митохондриального дыхания и гликолиза в отдельных митохондриях, в синаптосомах и в целых клетках с применением пермеабилизующих (повышающих проницаемость мембраны) реагентов.

Оценка митохондриального дыхания методом XF

Оценку проводят по четырем параметрам:

Митохондриальное дыхание оценивается по скорости поглощения кислорода (oxygen consumption rate, OCR). Существует представление о стрессовом профиле митохондриального дыхания (рис. 4). Для его формирования в исследуемые образцы поэтапно добавляют вещества-разобщители дыхательной цепи, или митохондриальные ингибиторы (см. врезку). При нормальном функционировании митохондрий они выявят метаболические резервы органелл. Например, добавление ротенона и антимицина нарушает работу комплексов I и III соответственно, заставляя работать другие элементы цепи в полную силу. В этом и есть исследовательская ценность метода XF: мы можем точно узнать, в какой части дыхательной цепи случилась «поломка», проверяя на прочность каждый из участков. Если же ингибиторы дыхания добавлять к образцам, где есть митохондрии, затронутые патологическим процессом, это позволит выявить «слабые» места метаболических реакций. Без дополнительной стимуляции эти нарушения трудно обнаружить, но стресс-тест для митохондрий выявит его. Получаемый при исследованиях тестовых культур профиль сравнивают со стандартным, чтобы получить данные о дефектах клеточного дыхания.

04.mitohondrialnyj stress test

Рисунок 4. Исследование митохондриального дыхания. На рисунке представлен стандартный стрессовый профиль реакции при изучении митохондриального дыхания, которая контролируется по скорости поглощения кислорода. Добавление различных разобщителей дыхательной цепи и метаболически активных веществ в течение опыта позволяет оценить параметры митохондриального дыхания. Желтая линия показывает изменения скорости поглощения кислорода при разных условиях, а цветные столбики являются производными от этих изменений.
Например, добавление карбонилцианид-4-(трифлуорометокси)фенилгидразона (FCCP) нарушает синтез АТФ. За счет «контрабанды» протонов мимо АТФ-синтазы из межмебранного пространства в матрикс электрохимический потенциал исчезает, и синтез АТФ постепенно снижается до нуля. Это разрывает процесс окислительного фосфорилирования, «заставляя» митохондрии работать на полную мощность. Они вынуждены «выталкивать» избыток протонов в межмембранное пространство, что приводит к увеличению потребления кислорода до максимума. Олигомицин нарушает фосфорилирование АДФ и его введение в образец снижает синтез АТФ. На рисунке это отражается как уменьшение скорости поглощения кислорода митохондриями. Запасная дыхательная емкость рассчитывается как разница между максимальным и базальным дыханиями.

рисунок предоставлен компанией «Биохиммак»

Митохондриальные ингибиторы, применяемые в стресс-тестах

Например, при добавлении в исследуемые образцы синаптосом нейронов ингибиторов комплексов I и II (ротенона и 3-нитропропионовой кислоты соответственно) отмечали резкое снижение показателей максимального дыхания, что моделировало болезни Паркинсона и Гентингтона [28]. Следовательно, нарушения в работе этих комплексов являются важным компонентом в развитии указанных нейродегенеративных заболеваний.

Также митохондриальную функцию можно оценивать и у целых клеток. Для создания модели болезни Паркинсона у модельных клеток подавляли продукцию митохондриальной аконитазы (m-аконитазы) [29]. Mитохондриальная аконитаза участвует в цикле Кребса, превращая цитрат в изоцитрат. Кроме этого она ответственна за поставку электронов (в виде NADH) для дыхательной цепи. Снижение функции m-аконитазы приводит к дефициту электронов. Как следствие, кислород не переходит в связанное состояние в комплексе IV, и его потребление снижается. При сравнении двух дыхательных профилей (рис. 5) становится очевидно, что у модельных клеток снижено базальное дыхание (часть графика до добавления олигомицина) и респираторная емкость (часть графика между добавлением FCCP и антимицина А (AA).

05.bolezn Parkinsona

Рисунок 5. Тестовое определение базального дыхания и дыхательной емкости у контрольной группы клеток в сравнении с модельными клетками при болезни Паркинсона (пояснения в тексте).

Если мы возьмем клетки реальных пациентов с болезнью Паркинсона, проведем их исследование с добавлением тех же реактивов в том же порядке и получим такие же результаты, то сможем сказать, что нарушения в работе этих нейронов, возможно, связаны с дисфункцией m-аконитазы. Здесь у нас открывается возможность для тестирования препаратов: мы можем исследовать образцы нейронов с потенциальными препаратами, добавляя к ним олигомицин, FCCP и антимицин A. Потенциально успешные препараты будут демонстрировать эффект в виде приближения кривой к нормальным показателям.

Такие эксперименты уже проводят. Например, метод XF позволил оценить нейропротекторный эффект меклизина при его использовании на клеточных моделях болезни Гентингтона [30]. Меклизин относится к противорвотным препаратам с антигистаминовой и антихолинергической активностью. Добавление меклизина к клеточным культурам с мутантным белком, отвечающим за развитие болезни Гентингтона, увеличило выживаемость клеток. При этом эффект реализовывался именно за счет нормализации процессов клеточного дыхания: меклизин может уменьшать образование эндогенных окисленных продуктов [31] и препятствовать высвобождению цитохрома C из митохондрий [32].

Оценка гликолиза методом XF

Кроме оценки митохондриального дыхания, методом XF можно оценить различные показатели гликолиза (рис. 6):

Ситуация здесь схожа с той, что обсуждалась при изучении митохондриального дыхания. Гликолитическую активность митохондрий оценивают по скорости внеклеточного закисления (extracellular acidification rate, ECAR).

06.glikoliznyj stress test

Рисунок 6. Исследование показателей гликолиза (стандартный стрессовый профиль реакции). Гликолиз косвенно оценивают по изменению pH среды. Добавление метаболически активных веществ, как и в случае с митохондриальным дыханием, позволяет изменять интенсивность процесса гликолиза, что и фиксируют при исследовании. Черная кривая с точками демонстрирует эти изменения, а цветные столбики являются производными от них. Добавление к исследуемым образцам 2-дезокси-D-глюкозы (2-DG) подавляет гликолитическую активность, в то время как раствор глюкозы и олигомицин значительно усиливают ее.

рисунок предоставлен компанией «Биохиммак»

Добавление различных субстратов проверяет на прочность метаболическую активность митохондрий, выявляя уязвимые места. Где тонко, там и рвется — метод XF ищет «тонкие» места в метаболизме митохондрий, потенциально указывая на то, что они могут быть усилены при помощи лекарств. Допустим, мы нашли, что при определенной патологии поражается комплекс III дыхательной цепи. Значит, поиск лекарства будет связан с выбором вещества, которое усиливает активность этого компонента и приводит к повышению выживаемости клеток, как это было показано выше в примере с миклезином и болезнью Гентингтона.

Инструмент для мастера

Качественное исследование в молекулярной биологии требует современного оборудования. Метод XF, изобретенный в 2006 году, используется в анализаторах компании Seahorse Bioscience (a part of Agilent Technologies, США). Оборудованием для анализа клеточного метаболизма, которое производит эта компания, пользуются ведущие мировые лаборатории. Счет исследованиям, при проведении которых использовали эти анализаторы, идет на сотни. В анализаторах Seahorse можно изучать параметры гликолиза и клеточного дыхания в 3D-культурах клеток, отдельных клетках, митохондриях и синаптосомах. Кроме того, для анализа могут быть использованы целые инсулярные островки поджелудочной железы.

Процедура исследования автоматизирована: необходимо только поместить изучаемые образцы в специальную планшетку и заполнить отделение для реагентов. Анализ метаболических показателей проводится благодаря твердофазным оптическим сенсорам, которые не повреждают клеточную культуру, и она может быть использована повторно в экспериментах. Те части прибора, которые контактируют с исследуемыми образцами, являются одноразовыми и не требуют отмывки. На саму процедуру анализа прибором уходят минуты, но получаемая информация обладает высокой точностью. Колебания давления кислорода оцениваются с чувствительностью в 0,67 mmHg (миллиметров ртутного столба); также прибор фиксирует изменение содержания ионов водорода на уровне пикомолей. При этом аппарат способен одновременно оценить клеточное дыхание и обмен глюкозы. Клеточное дыхание измеряется по уровню потребления кислорода, а обмен глюкозы — по уровню продукции протонов водорода в изучаемых образцах. Двух этих параметров достаточно, чтобы полноценно оценить метаболическую функцию клетки и ее нарушения.

Благодаря системе автоматических инъекционных портов в ходе измерений может быть добавлено до четырех веществ, влияющих на метаболизм — ингибиторы клеточного дыхания, различные токсины и цитопротекторы. Учитывая то, что в одном планшете одновременно можно тестировать до 96 образцов, исследовательские возможности прибора становятся просто колоссальными. О производительности и качестве приборов говорит и то, что их использовали в Национальной программе США по исследованию токсических веществ, где анализу подвергли более 1300 химических соединений [33].

Если говорить о компонентах для анализа, то готовые реагенты поставляет сама компания Seahorse, в том числе и реагенты для контроля состояния приборов. Расход реагентов при процедуре анализа методом XF ниже, чем при традиционных методах. Это достигается за счет того, что клеток для работы требуется в 10–20 раз меньше.

Если сравнивать XF-анализаторы митохондриального метаболизма с приборами на основе других методов, то можно отметить ряд несомненных преимуществ. Одним из способов измерения концентрации кислорода при исследовании митохондрий является использование электродов Кларка или автоматизированной аппаратуры на их основе — оксиграфов. Главный их недостаток — необходимость большого количества материала для исследования, что исключает изучение синаптосом. Масс-спектрометрия и газовая хроматография дóроги и требуют длительной подготовки анализируемого материала. Это усложняет их применение на практике. Еще одно преимущество XF-анализиторов — это способность одновременно измерять динамику pH и концентрацию кислорода в пробах, что дает исследователю комплексное представление о метаболизме глюкозы и митохондриальном дыхании.

Заключение

Как показывает множество исследований, при нейродегенеративных заболеваниях происходит значительное нарушение функции митохондрий. Может нарушаться их движение внутри нейрона, а также процессы их слияния и разделения. Такие изменения приводят к нарушению метаболических процессов, протекающих внутри этих органелл: клеточного дыхания и гликолиза. Их можно косвенно оценить по колебаниям концентрации кислорода и pH. В этом поможет высокоточный и надежный метод анализа внеклеточных потоков — XF (extracellular flow). Он позволяет изучать как живые клетки, так и отдельные митохондрии и синаптосомы. Исследование метаболической активности митохондрий дает информацию, которая позволяет не только пролить свет на патогенез заболевания, но и выяснить, какие лекарственные средства будут эффективны для их лечения.

ЗАО «БиоХимМак» — спонсор спецпроекта по биоэнергетике

Отдел молекулярной диагностики (Life Science MDx) «БиоХимМак» предлагает высокотехнологичные инструменты для решения научных и диагностических задач в областях молекулярной и клеточной биологии, генетики и биотехнологии. В сферу наших интересов входят:

Наши сотрудники оказывают помощь

Мы осуществляем

Мы работаем

Анализаторы Seahorse (Agilent Technologies, США)

Seahorse — один из самых передовых исследовательских инструментов, «золотой стандарт» в изучении клеточного метаболизма:

Материал предоставлен партнёром — компанией «БиоХимМак»

Источник

Adblock
detector